Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является одним из весьма эффективных методов, применяемых для разделения сложных смесей. В основе метода лежит участие элементов разделяемой смеси в системе Ван-дер-Вальсовых взаимодействий на границе разделения фаз. проведение ВЭЖХ включает этап, в котором необходимо разделить исследуемую сложную смесь на более простые. Далее полученные смеси можно исследовать различными методами. Принцип ВЭЖХ заключается в различиях в равновесном распределении компонентов смеси между фазами (неподвижной и подвижной).

При проведении метода применяется большое давление (доходящее до 400 бар), а также мелкозернистые сорбенты. Это дает возможность разделить смеси достаточно быстро и достоверно.

ВЭЖХ успешно используется в различных сферах, в частности в химии, биологии, пищевой промышленности, нефтехимической отрасли, биотехнологии, экологии, производстве лекарственных средств.

Классификация ВЭЖХ

ВЭЖХ по механизму разделения смеси делят на:

  • распределительную,
  • лигандообменную,
  • адсорбционную,
  • эксклюзионную,
  • ионообменную.

Важно учитывать тот факт, что на практике зачастую смеси разделяются не по одному конкретному механизму, а одновременно по нескольким. К примеру, эксклюзионное разделение может осложниться присутствием адсорбционных эффектов, в свою очередь в адсорбционном разделении могут появиться распределительные эффекты. Чем больше вещества смеси различаются по степени кислотности, ионизации, основности, поляризуемости либо по молекулярной массе, а также прочим характеристикам, тем выше вероятность того, что в процессе исследования возникнет другой механизм.

Нормально-фазовая ВЭЖХ

При проведении данного метода неподвижная фаза обладает большей полярностью, в отличие от подвижной. По этой причине в состав элюента входит основная часть неполярного растворителя, а именно:

  • хлороформ и метанол в соотношении 80/20, он используется для сильнополярных веществ;
  • хлороформ и метанол в соотношении 80/20, он требуется для среднеполярных веществ;
  • гексан и изопропанол в соотношении 95/5, он применяется для малополярных веществ.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ

В этом случае используют неполярную неподвижную фазу и полярные растворители. В качестве неполярной фазы выступает силикагель, при этом его поверхность модифицируют. Для подвижной фазы берут водные растворители. Данный метод встречается очень часто, поэтому можно встретить его описание как простой ВЭЖХ без дополнительных обозначений. Фармацевтические компании используют обращенно-фазовую ВЭЖХ для анализа лекарственных средств (является обязательным методом) перед тем, как их выпускать.

Принцип ОФ-ВЭЖХ заключается в гидрофобных взаимодействиях. Они возникают в результате высокой симметрии в структуре молекулы воды. Благодаря данному методу можно измерить силы такого взаимодействия. Исследуемое вещество связывается с неподвижной фазой соответственно площади поверхности взаимодействия вокруг неполярного элемента молекулы исследуемого вещества и лиганда неподвижной фазы.

Структурные характеристики молекулы исследуемого вещества очень важны в параметрах ее удерживания на неподвижной фазе. Таким образом, вещество со значительной гидрофобной составляющей удерживается более долгое время, так как оно не вступает во взаимодействие с водной поверхностью. Исследуемые вещества со значительной полярной частью в своем строении удерживаются менее длительное время, поскольку они могут лучше связываться с водой. Такого рода взаимосвязи могут быть подвержены стерическим эффектам. Молекулы очень большого размера имеют ограниченный доступ к порам неподвижной фазы, где осуществляются взаимодействия с алкидными цепочками (поверхностными лигандами). Это препятствие, как правило, вызывает сокращение удерживания.

Если увеличивается площадь неполярной поверхности, то увеличивается и время удерживания. Если вещество имеет разветвленные цепочки, то они будут вымываться быстрее, так как уменьшается площадь всей поверхности. Схожие органические вещества, которые имеют единичные связи С-С, будут вымываться позже, поскольку двойные и тройные связи являются более короткими.

Еще одним немаловажным фактором является рН подвижной фазы. Этот показатель может оказать влияние на изменение гидрофобный характер исследуемой смеси. Поэтому при проведении некоторых методов применяются буферные агенты, например, натрия фосфат. Буферные растворы выполняют несколько функций: они контролируют рН, являются агентами ионных пар, нейтрализуют заряд на поверхности силикагеля. В масс-спектрометрии зачастую применяют формиат аммония, так как он позволяет улучшить обнаружение ряда аналитов посредством образования аналит-аммонийных аддуктов. Уксусная, муравьиная или другие летучие кислоты нередко добавляют в подвижную фазу при проведении анализа элюируемого компонента колонки. В общем можно сказать, что эффекты буферных растворов и кислот улучшают результаты, полученные при хроматографировании смеси, но они имеют отличия в зависимости от того, какой именно вид используется.

Колонки для обращенно-фазовой ВЭЖХ трудно повредить, в отличие от колонок с силикагелем. Но в состав большей части ОФ-колонок входят алкил-производные силикагеля, а их нельзя применять совместно с водными основаниями, поскольку они погубят основные элементы силикагеля. Их можно использовать с растворами кислот на водной основе, но в таком случае колонка не должна долга находиться под воздействием кислот, так как может появиться коррозия на металлических частях устройства ВЭЖХ. Колонки нужно промывать с помощью чистого растворителя и хранить в подходящем растворителе. В колонках должна содержаться малое количество металлов.

Матрицы, используемые для ВЭЖХ

Для проведения ВЭЖХ в качестве матриц применяют неорганические соединения, например, оксид алюминия, оксид кремния (силикагель), органические полимеры. Конечно, на сегодняшний день, чаще всего для исследования используют силикагель.

Основными характеристиками матриц являются размер частиц и размер внутренних пор.

Силикагель для ВЭЖХ получают следующим способом. Сначала формуются микросферы поликремневой кислоты, затем частицы силикагеля высушивают, а далее происходит воздушное сепарирование.

Различают два вида частиц сорбента:

  • несферические – для них характерна низкая устойчивость к давлению;
  • регулярные (сферические) – имеют более высокую устойчивость к давлению, их стоимость на порядок выше.

Одним из самых важных параметров считается размер пор в ВЭЖХ. Чем больше размер пор, тем лучше их способность к проникновению для молекул элюируемых элементов, и тем лучше сорбционная емкость используемых сорбентов. Если поры имеют более крупный размер, то уменьшается сорбционная поверхность, механическая устойчивость частиц сорбента. В результате эффективность метода снижается.

Прививки стационарной фазы

Для нормально-фазовой ВЭЖХ применяются следующие прививки неподвижной фазы:

  • с пропиламинной прививкой,
  • с пропилнитрильной прививкой.

При проведении обращенно-фазовой ВЭЖХ используют следующие неподвижные фазы:

  • с алкильной прививкой,
  • с алкилсилильной прививкой.

Не привитые фрагменты сорбента дополнительно прививают маленькими молекулами. Такой процесс называется энд-кэппированием. Если речь идет о гидрофобном энд-кэппинге, то в этом случае характерна низкая смачиваемость и высокая селективность. При гидрофильном энд-кэппинге наблюдается низкая селективность и высокая смачиваемость.

Детекторы для проведения ВЭЖХ

Детекторы фиксируют изменения свойств растворителя, который выходит из колонки. Такие изменения имеют связь с присутствием в растворителе исследуемых компонентов смеси. Примером может быть изменение оптических характеристик элюента, способности к флюоресценции, показателей преломления, способности к окислению либо восстановлению, электропроводности и прочие изменения.

Детекторы подразделяют на:

  • селективные,
  • универсальные.

Первый вид детекторов широко используется для исследования следовых количеств фармацевтических препаратов в различных биологических материалах, а также биогенных аминов, микропримесей. Селективные детекторы могут фиксировать элюирование анализируемых веществ, которые имеют специфические свойства. К таким детекторам относятся электрохимический, флуоресцентный и прочие.

Универсальные детекторы реагируют на элюирование веществ независимо от того, присутствуют ли у них какие-то особенные характеристики. Эти детекторы успешно применяются в нефтехимической, медицинской, химической, фармацевтической промышленности.

Новости и пресс-релизы
В R&D-лаборатории «Биохимик» выпустили первую российскую субстанцию
В R&D-лаборатории «Биохимик» выпустили первую российскую субстанцию
14.08.2017
В ходе визита на производственную площадку ПАО «Биохимик» в Саранске врио главы Республики Мордовия была произведена первая в регионе отечественная субстанция. Разработкой и лабораторным выпуском этой субстанции ознаменовался первый этап выполнения работ ГК «Фармконтракт» по реконструкции и обновления парка лабораторного оборудования «инновационного» корпуса завода.
Инновационные системы охлаждения Arctiko – ультранизкая температура гарантирована
Инновационные системы охлаждения Arctiko – ультранизкая температура гарантирована
07.08.2017
Хранение образцов отдельных особо ценных химических веществ в фармацевтике, уникальных образцов тканей, клеток, ДНК – сложная задача, учитывая необходимость поддерживать низкую температуру в течение длительного временного периода.
Планетарный лабораторный смеситель CREAMIX 7.0
Планетарный лабораторный смеситель CREAMIX 7.0
19.07.2017
Планетарный лабораторный смеситель CREAMIX 7.0 производства компании Farmalabor Tech предназначен для смешивания различных веществ и создания субстанций однородной массы.

Оборудование в лизинг

Расходные материалы для аналитического и технологического оборудования

Фото компании
Фармконтракт - Лабораторное оборудованиеФармконтракт - Лабораторное оборудованиеФармконтракт - Лабораторное оборудованиеФармконтракт - Лабораторное оборудованиеФармконтракт - Лабораторное оборудование